2020/12/21 12:03:21
提取組織器官RNA|凈信多樣品組織勻漿機實驗案例
來源：上海凈信
組織樣品中RNA的提取實驗：本實驗的組織樣品主要有小鼠的各個組織器官（如肝臟，肌肉，脂肪等）和人腫瘤標本（如結直腸癌，肺癌，乳腺癌）
1.首先要根據需要抽提的組織樣品的質量加入相應的TRIZOL液體，同時加入若干顆不銹鋼柱。本實驗室一般情況如下：（小鼠組織加入TRIZOL,結直腸癌標本加入TRIZOL）
注意：
a.用凈信勻漿機進行勻漿處理時樣品體積不要超過TRIzol體積10℅）
b.需事先預冷試管座
2.把加入樣品,TRIZOL,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預冷好的試管座中。機器設置好參數蓋上蓋子，點擊運行
3.機器運行完畢后，打開蓋子，拿出凈信EP管仔細觀察組織的研磨情況，如果沒有明顯的塊狀物，那就可以進入下一步實驗步驟，如果沒有完全打碎，還需要把EP管放入試管座中，繼續勻漿。有些堅硬，或者脂肪含量高的組織（乳腺）可能需要稍微長一點的時間，時間可以依據組織實際的研磨情況來調整勻漿時間。
4.和傳統的TRIZOL提取RNA的方法一樣,將勻漿樣品在室溫放置幾分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩若干秒，室溫放置幾分鐘。
6.2-8℃10000×g離心十幾分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。
7.把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入異丙醇，室溫放置幾分鐘。
8.2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。
9.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心幾分鐘，棄上清。
10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入無RNase的水,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。
常見問題分析：
1得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B.RNA沉淀未完全溶解
C.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高
D．樣品勻漿時加的試劑量太少
E．勻漿樣品時未在室溫放置幾分鐘
F．吸取水相時混入了有機相
2 RNA降解
A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍
B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.細胞在用胰酶處理時過度
D.溶液或離心管未經RNase去除處理
E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5
3 DNA污染:
A.樣品勻漿時加的試劑量太少
B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液
預防RNA污染注意事項：
1．經常更換新手套，皮膚上常帶有的細菌，霉菌可能成為RNase的來源。
2．使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。
3．RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染，但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
4．配制溶液應使用無RNase的水
本實驗已經研磨的各個組織中發現肝臟組織是很容易研磨且研磨效率是很好的。
下圖A是RNA經過傳統的液氮研磨和勻漿器研磨法抽出的RNA跑膠圖，結果很明顯發現這種方法是可行的，是可以代替傳統的方法的。
下圖B是利用組織勻漿器對小鼠的各個組織進行勻漿抽出的RNA跑膠圖。發現在抽提各個組織的RNA的時候也是可行的。
圖C是利用組織勻漿器對人結腸癌標本進行了研磨后抽提出的RNA的跑膠圖。
圖D是小鼠的肝臟組織經過手工研磨和機器勻漿后，抽提得到的RNA進行了濃度的測定，結果說明組織勻漿器抽提出得RNA的濃度要顯著高于傳統的手工的方法得到的RNA。
蛋白質的提取
A.根據需要抽提的組織樣品的質量加入相應的蛋白質裂解液（如RIPA），同時加入3顆不銹鋼柱。（小鼠肝臟組織加入1mlRIPA蛋白裂解液，人結直腸癌組織加入500ulRIPA蛋白裂解液）
B.把加入樣品,蛋白裂解液,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預冷好的試管座中。機器設置好參數蓋上蓋子，點擊運行。
以下同上RNA的操作方法：
所得到的蛋白質濃度的測定經過BCA試劑盒測定完成的，同時通過SDS-PAGE后經過考馬斯亮藍染色和western blot檢測都發現其要比傳統的方法更加簡便快捷，不容易引起交叉污染。
更多實驗細節可致電工作人員！
